Эритропоэтин, EPO (Biomerica, США)

Назначение

Тест Biomerica ЭПО ИФА (Biomerica EPO ELISA) – диагностическая in vitro иммуноферментная (ИФА) тест-система для количественного определения эритропоэтина (ЭПО) в сыворотке крови. Тест предназначен для диагностики анемий и полицитемий. С внедрением рекомбинантного эритропоэтина в практику биологической терапии для увеличения клеточной массы эритроцитов, тест стал необходим и для прогнозирования и мониторинга результатов лечения рекомбинантным эритропоэтином больных с анемиями.

Введение и клиническое значение

Эритропоэтин (ЭПО) является сильногликозилированным белком с молекулярной массой около 30 000 – 34 000 Да. ЭПО человека – это полипептид, состоящий из 165 аминокислотных остатков, содержащий одну О- и три N-связанных углеводородных цепей1. Рекомбинантный ЭПО – хороший заменитель нативного белка при использовании в иммуноанализе2. Уровни ЭПО в сыворотке крови зависят от скорости выработки и скорости расщепления белка. 90% ЭПО продуцируется в околоканальцевых клетках почек взрослых людей в ответ на снижение снабжения тканей кислородом3,4. Имеются доказательства того, что белок на этих клетках, который реагирует на насыщение крови кислородом, обладает гем-содержащим компонентом5. Как и рО2 плазмы, функция гематокрита снижается, а концентрация ЭПО возрастает6. Также имеются наблюдения о том, что в норме существует обратная зависимость между уровнем сывороточного ЭПО и эритроцитарной клеточной массой7.

Количественное определение концентрации эритропоэтина в сыворотке крови способствует диагностике анемии или эритроцитоза. К повышению концентрации сывороточного ЭПО приводят апластическая анемия, гемолитическая анемия и анемия вследствие дефицита железа. В то же время уровни ЭПО у пациентов со вторичной анемией, возникшей вследствие почечной недостаточности и других заболеваний, таких как синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), обычно неадекватно низки по сравнению со степенью анемии. Наиболее вероятно это связано с невозможностью продуцировать необходимое количество ЭПО поврежденными почками 8. Низкие концентрации ЭПО могут служить ранним признаком отторжения почечного трансплантанта10. ЭПО может быть использован и для контроля за состоянием больных СПИД, получающих лечение зидовудином (AZT). Повышенные концентрации ЭПО подтверждают, что анемия, ассоциированная с лечением зидовудином, связана с гипоплазией или аплазией эритроцитов10.

Полицитемия rubra vera или первичный эритроцитоз (повышенное содержание эритроцитарной клеточной массы) является следствием нестимулированной перепродукции эритроцитов. Таким образом, повышение уровня гемоглобина вызывает снижение продукции ЭПО и, вследствие этого, субнормальные уровни сывороточного ЭПО9. Вторичные полицитемии, которые также характеризуются повышением общей эритроцитарной клеточной массы, являются физиологическим ответом на повышенные уровни циркулирующего ЭПО, вызванные гипоксией тканей. Гипоксия может быть обусловлена такими факторами, как фиброз легких, сердечно-сосудистые заболевания, продолжительное пребывание на больших высотах, аномальные формы гемоглобина или лечение лекарственными препаратами.

Принцип метода

Тест Biomerica ЭПО ИФА (Biomerica EPO ELISA) представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ «сэндвич»-типа для определения концентрации биологически активной цепи ЭПО, состоящей из 165 аминокислот. В тесте используются два типа мышиных моноклональных антител к ЭПО человека, специфичным к двум разным эпитопам молекулы ЭПО. Первые моноклональные антитела биотинилированы, вторые – мечены пероксидазой хрена (HRP).В данном анализе калибраторы, контроли или образцы сыворотки крови пациентов одновременно инкубируют с конъюгированными с ферментом антителами и меченными биотином антителами в лунках планшета, покрытыми стрептавидином. Таким образом, ЭПО образца оказывается в «сэндвиче» между двумя антителами. После инкубации лунки планшета промывают для удаления несвязавшихся компонентов. Фермент, связавшийся с твердой фазой, инкубируют с субстратом тетраметилбензидином (ТМБ). Реакцию останавливают добавлением в лунки кислотного стоп-реагента, при этом цвет раствора становится желтым. Интенсивность желтого окрашивания прямо пропорциональна концентрации ЭПО в образце. На основании данных, полученных для калибраторов, строится калибровочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации ЭПО. Концентрацию ЭПО в контролях и исследуемых образцах определяют непосредственно по этой кривой. Калибраторы набора Biomerica ЭПО ИФА откалиброваны относительно 1-го Международного стандарта Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) для эритропоэтина, который состоит из полученного рекомбинантным способом эритропоэтина, 1st International Standard (87/684).