Биогенные амины (БА) – эндогенные биологически активные производные ароматических аминокислот, участвующие в осуществлении и регуляции многочисленных и разнообразных физиологических процессов. Они хорошо известны как медиаторы передачи нервного импульса и как гормоны. Активно исследуется участие этих веществ в различных иммунологических и воспалительных реакциях [4, 41, 56].
В связи с этим определение концентрации БА в крови, моче и других биологических жидкостях важно для диагностики и мониторинга многих заболеваний и функциональных состояний организма. Кроме того, они являются специфическими маркерами развития некоторых опухолей.
Для измерения концентрации биогенных аминов используется ряд современных биохимических и иммунохимических методов, пришедших на смену недостаточно чувствительному колориметрическому определению. К ним относятся высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуоресцентной, электрохимической [25] и масс-спектрометрической детекцией [23] и газовая хроматография (ГХ) с масс-спектрометрической детекцией [62]. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и точность измерения, однако для их использования необходимы дорогостоящее оборудование и реагенты и высококвалифицированный персонал.
Другим направлением является разработка иммунохимических методов, основанных на специфическом узнавании молекул БА молекулами соответствующих антител. К ним относятся радиоиммунологический и иммуноферментный методы анализа. Первые попытки разработки иммунохимических тестов встретили значительные трудности, так как низкомолекулярные молекулы БА практически не обладают свойствами антигенов и, даже будучи конъюгированными с белком-носителем, не вызывают образования антител, аффинность которых достаточна для достижения требуемой чувствительности анализа. Успешное решение было найдено, когда обнаружили, что ацилирование молекул БА резко усиливает их антигенные свойства. Были получены высокоаффинные поли- и моноклональные антитела к ацильным производным БА и разработана методика ацилирования молекул БА в исследуемых и контрольных образцах в процессе проведения анализа [63]. Это сделало возможным создание иммуноферментных и радиоиммунологических диагностических наборов, по чувствительности, специфичности и точности определения не уступающих хроматографическим методам, но более простых, привычных по формату для лабораторного персонала и легко поддающихся автоматизации.
Катехоламины
Катехоламины (КА) – группа ароматических аминов, включающая адреналин (эпинефрин), норадреналин (норэпинефрин) и дофамин. Адреналин и норадреналин синтезируются из дофамина – производного аминокислоты фенилаланина. Основная часть адреналина синтезируется в мозговом веществе надпочечников, норадреналина и дофамина – в нервных клетках. Активная секреция адреналина и норадреналина связана с реакцией организма на стресс. При этом их концентрация в крови и моче может возрасти во много раз, после чего уровень КА в крови быстро восстанавливается, тогда как концентрация метаболитов – метанефрина и норметанефрина (вместе обозначаются как «метанефрины») – остается высокой. Уровень катехоламинов может значительно изменяться при гипертонии, кардиопатиях, депрессиях [19, 21] и многих других патологических состояниях, однако эти изменения зависят от многих факторов и часто краткосрочны.
Большое клиническое значение имеет определение КА и их производных в крови и моче при развитии ряда опухолей. Их концентрация увеличивается при развитии нейробластом, феохромоцитом и ганглионевром. Клетки этих опухолей имеют нейроэндокринное происхождение и секретируют КА и метанефрины. Даже если опухоль является доброкачественной, постоянное выделение КА в кровь может привести к тяжелым последствиям, вплоть до гибели больного. Основными симптомами являются приступы гипертонии, причину которых необходимо установить, а также головная боль, повышенное потоотделение, тахикардия. Если преобладает секреция норадреналина, симптоматика выражена слабее.
Феохромоцитомы – доброкачественные, редко злокачественные опухоли мозгового вещества надпочечников [1] – являются источником секреции КА, метанефрина и норметанефрина. Их раннее выявление очень важно, так как при своевременном обнаружении хирургическое лечение обычно является успешным [36]. Сходные опухоли, расположенные вне надпочечника (секретирующие параганглиомы), обычно выделяют норадреналин и норметанефрин. Как правило, концентрация КА и их метаболитов увеличивается как в плазме крови, так и в моче. Основное диагностическое значение имеет определение метанефринов, поскольку основная часть молекул метанефринов образуется из КА еще внутри клетки до поступления кровоток [14]. Степень возрастания уровня метанефрина и норметанефрина хорошо коррелирует с размером опухоли, в отличие от КА, уровень которых является более вариабельным [11, 16]. Основная часть метанефринов в плазме и особенно в моче находится в виде сульфоконъюгатов, и для их суммарного определения нужно провести предварительный гидролиз образца. Образование сульфоконъюгатов происходит не в надпочечниках, а главным образом в клетках желудочно-кишечного тракта, и зависит как от местной секреции КА, так и от диеты [14]. Поэтому неудивительно, что, несмотря на то, что концентрация суммарных метанефринов значительно выше, определение именно свободных метанефринов в плазме обеспечивает наибольшую клиническую чувствительность [43, 58]. Если содержание свободных метанефринов в плазме не увеличено, это с высокой степенью вероятности свидетельствует об отсутствии секретирующей КА опухоли [26, 45, 47]. Специфичность анализа значительно увеличивается, если одновременно определять метанефрин и норметанефрин и в плазме, и в моче [48, 52]. Ложноположительные реакции, связанные с влиянием лекарств, можно исключить, определяя отношения метанефрин/адреналин или норметанефрин/норадреналин (в зависимости от преобладания секреции), а также по реакции на клонидиновую пробу [12]. Проблемы, связанные с лабораторной диагностикой феохромоцитомы в моче, проанализированы в обзоре [44]; определение свободных метанефринов в моче позволяет диагносцировать опухоль с высокой клинической чувствительностью [5].
Описаны случаи резкого увеличения активности секреции адреналина у больных с феохромоцитомой при назначении глюкокортикоидов. При наличии определенных клинических симптомов (головная боль, гипертония, тахикардия, боль в области груди или живота) назначение этих препаратов, вероятно, требует предварительного обследования на наличие феохромоцитомы [51].
Все более широкое распространение методов сканирования брюшной полости привело к частому случайному обнаружению новообразований («инсиденталом», от англ. incidental – «случайный») в надпочечниках; обычно это происходит при проведении исследований, назначенных по другому поводу. В случае обнаружения такой опухоли необходимо выяснить, не секретирует ли она КА [40, 64], для чего измеряют концентрации КА и их производных [54].
Мониторинг концентрации КА и метанефринов может также применяться для контроля эффективности хирургического лечения феохромоцитомы [49]. При радикальном удалении опухоли концентрация маркеров постепенно нормализуется [46].
Снижение содержания метанефринов как в плазме, так и в моче выявлено при врожденной гиперплазии коры надпочечников – заболевании, при котором нарушен синтез кортизола из-за дефицита 21-гидроксилазы. Наблюдалась корреляция между этим снижением и выраженностью дефицита фермента, что подтверждает регулирующее влияние глюкокортикоидных гормонов на функцию клеток мозгового вещества надпочечников. Восстановление уровня кортизола за счет ввода экзогенного гормона не приводит к восстановлению нормального уровня концентрации метанефринов [34].
Увеличение уровня дофамина и его метаболита 3-метокситирамина в крови и моче наблюдается у детей при развитии нейробластомы [6, 24]. Если при клиническом обследовании возникает подозрение на наличие нейробластомы, измерение концентрации дофамина может дать лабораторное подтверждение клинических данных. Развитие нейробластомы может сопровождаться также увеличением содержания норадреналина и норметанефрина в моче; при этом показано, что отношение концентрации норадреналина [17] или ванилилминдальной кислоты [57] к концентрации дофамина в моче характеризует активность дофамин-β-гидроксилазы в клетках опухоли и может служить прогностическим показателем: чем выше это отношение, тем более дифференцированные клетки образуют опухоль. Описан случай, когда, после проведения химиотерапии, из нейробластомы образовалась опухоль, состоящая из более зрелых клеток и сходная с ганглионевромой; при этом процесс химиотерапии сопровождался повышением концентрации норметанефрина и (в меньшей степени) ванилилминдальной кислоты в моче [7].
Повышение концентрации дофамина в моче выявлено и при некоторых других заболеваниях: карциноиде (у взрослых), феохромоцитоме (у взрослых и детей), синдроме Костелло, лейкемии, синдроме Менкеса и рабдомиосаркоме мочевого пузыря (у детей). Кроме того, такое повышение может быть связано с лекарственной терапией (дофамин внутривенно, леводофа, метилдофа, клозапин, антидепрессанты, метоклопрамид) и встречается во время беременности [10]. Редкие, продуцирующие дофамин параганглиомы выявляли по увеличению содержания O-метилокситирамина (метаболит дофамина, аналогичный метанефринам) в плазме [15].
Серотонин
Серотонин, или 5-гидрокситриптамин (5-ГТ), – биогенный амин, являющийся производным триптофана. Он хорошо изучен как медиатор серотонинэргических нейронов ЦНС, участвующих в регуляции сна, аппетита, поведенческих реакций. Основная часть серотонина за пределами ЦНС находится в тромбоцитах. Кроме того, он содержится в тучных клетках, базофилах и хромаффинных клетках кишечника. Эффекты серотонина разнообразны. Он оказывает стимулирующее влияние на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов, бронхиол, кишечника; недостаточность серотонина может привести к функциональной кишечной непроходимости. Повышенный уровень серотонина в крови обнаружен при воспалительных реакциях и активации тромбоцитов. В последнее время обнаружено и активно исследуется влияние серотонина на иммунологические процессы, в частности, миграцию клеток иммунной системы, их взаимодействие, фагоцитоз, продукцию цитокинов и т.д. [8, 22]
Повышение содержания серотонина в плазме и моче является весьма специфичным маркером карциноида ЖКТ и легких, которые составляют до 85% новообразований нейроэндокринного происхождения в ЖКТ [32]. Их развитие часто сопровождается вызванным серотонином повреждением сердечных клапанов [28]. Измеряя концентрацию серотонина, можно оценить качество проведенной операции по удалению опухоли, а также предположить наличие или отсутствие метастазов.
Маркером наличия таких опухолей также является метаболит серотонина – 5-гидроксииндолуксусная кислота [37].
Во многих исследованиях определяли содержание серотонина в тромбоцитах при депрессии [33]. Пониженный уровень серотонина был обнаружен у больных с психотическими симптомами при болезни Альцгеймера [35]. Снижение содержания серотонина в тромбоцитах при гипотиреозе коррелировало со степенью выраженности симптомов депрессии и, по мнению авторов, может служить маркером депрессивного состояния у этих больных [55]. Многочисленные исследования связывали снижение содержания серотонина со склонностью к повторному покушению на самоубийство, однако возможность использования его в качестве маркера этого состояния вызывает сомнения [38].
Надежным маркером депрессии является снижение концентрации 5-гидроксииндолуксусной кислоты в спинномозговой жидкости.
Гистамин
Гистамин – биогенный амин, хорошо известный как медиатор аллергической реакции гиперчувствительности немедленного типа. Он содержится главным образом в тучных клетках и базофильных лейкоцитах. При анафилактических и аллергических реакциях, опосредованных гистамином, его концентрация возрастает пропорционально интенсивности реакции [9, 61]. Концентрацию гистамина определяют в плазме, моче, а также супернатантах культуры клеток после контакта с аллергеном. Изменение концентрации коррелирует с эффективностью терапии специфическими антагонистами. Так, при профилактическом приеме гидроксизина и хлорферамина - антагонистов рецепторов гистамина типа H-1 и H-2 - наблюдалось снижение чувствительности больных с аллергией к мидазолам-кетаминовой анестезии и уровень гистамина в плазме не увеличивался [20].
Обнаружено повышение концентрации гистамина в плазме при проведении коронарной ангиографии у больных ишемической болезнью сердца, по-видимому, не связанное с развитием аллергических реакций, опосредованных IgE [50].
Содержание гистамина в плазме и моче увеличивается также при непереносимости гистамина, поступающего с пищей, связанного со сниженной активностью диаминоксидаз; симптомы этого состояния сходны с аллергическими [30].
Отдельной областью лабораторного анализа является определение гистамина в продуктах питания. Он образуется из гистидина за счет действия декарбоксилаз микроорганизмов (многих видов бактерий и некоторых видов дрожжевых грибов). Поэтому его содержание велико в сырах, красном вине, квашеной капусте, некоторых видах мясопродуктов [3, 18]. В случае, если технология приготовления не предполагает роста микроорганизмов, выявление гистамина свидетельствует о микробном заражении продукта. В частности, гистамин определяют для санитарно-гигиенического контроля свежей рыбы и рыбной муки [2].
Иммуноферментный анализ
В вышеупомянутых исследованиях БА чаще всего измерялись с помощью хроматографических методов, точных и высокочувствительных, однако предъявляющих высокие требования к персоналу и дорогостоящих, что существенно ограничивает внедрение их в широкую лабораторную практику [13, 53]. Появление новых иммуноферментных наборов, не уступающих по чувствительности и специфичности методам ВЭЖХ и ГХ, создает возможность проводить анализ БА, используя уже существующую инструментальную базу и опыт сотрудников, владеющих техникой широко распространенного метода ИФА.
Иммуноферментный анализ БА имеет ряд особенностей. Специфические высокоаффинные антитела удается получить только к молекулам ацилированных производных БА [29, 39, 42]. Поэтому в процессе проведения анализа БА, содержащиеся в исследуемых и контрольных образцах, также подвергаются ацилированию с помощью специального реагента. В состав наборов для определения КА также входит дополнительный планшет для ковалентной экстракции молекул КА из образцов и последующего ацилирования. Методика, используемая в иммуноферментных наборах производства компании «Labor Diagnostika Nord» (Германия), обеспечивает высокую специфичность экстракции, что является необходимым условием специфичности самого анализа. Возможно определение как свободных, так и суммарных (свободных и конъюгированных) КА и метанефринов в моче. Для определения БА после экстракции и модификации чаще всего используется конкурентный метод. Помимо иммуноферментного, возможно проведение и радиоиммунологического анализа [27].
Стадии обработки образца, предшествующие собственно иммуноферментному анализу, в соответствии с технологией, использованной в наборах «Labor Diagnostika Nord», приведены на Рисунке 1
(Химические реакции КА, предшествующие иммуноферментному анализу). Экстракция, ацилирование и гидролиз проводятся в лунках специального планшета, входящего в состав набора. Затем аликвота образца переносится в планшет для проведения ИФА и метилируется по OH-группе (если определяются КА, но не метанефрины), после чего проводится конкурентный иммуноферментный анализ.
Проведенные сравнительные исследования показали высокую степень корреляции результатов ИФА с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии [31, 60]. Аналитическая чувствительность ИФА разных БА составляет 5–20 пг/мл. Показано, что лекарственные препараты, обычно назначаемые больным, у которых присутствует или может быть заподозрена феохромоцитома, на результаты измерения содержания метанефрина и норметанефрина в моче не влияют [59].
В процессе экстракции молекул КА из образца и модификации их происходит несколько химических реакций. Их высокая специфичность является причиной отсутствия перекрестных реакций со стороны лекарственных препаратов, молекулы которых имеют сходную структуру (Рисунок 2.
Факторы, определяющие специфичность иммуноферментного анализа КА).
При использовании наборов последнего поколения (марка Fast Track) производства компании «Labor Diagnostika Nord», по данным производителя, существенно увеличивается чувствительность и уменьшается время проведения анализа.
Появление усовершенствованных вариантов метода иммуноферментного анализа создает дополнительные возможности для определения содержания биогенных аминов и открывает перспективу широкого внедрения этих тестов в лабораторную практику.
Перечень тест-систем для ИФА производства компании «Labor Diagnostika Nord».
