Главная
Пресс-центр
Публикации
О методах обнаружения антител к SARS-CoV-2 и их корреляции с уровнем нейтрализующих антител

О методах обнаружения антител к SARS-CoV-2 и их корреляции с уровнем нейтрализующих антител

16.07.2020

Реконвалесцентная плазмотерапия для лечения пациентов с COVID-19: оценка эффективности, доступные методы обнаружения антител и их корреляция с уровнем нейтрализующих антител

Публикация: "Convalescent plasma therapy for the treatment of patients with COVID-19: Assessment of methods available for antibody detection and their correlation with neutralising antibody levels" - оригинал статьи в pdf

Heli Harvala¹, Matthew L Robb², Nick Watkins³, Samreen Ijaz⁴, Steven Dicks⁴, Monika Patel⁵, Piyada Supasa⁶, Wanwisa Dejnirattisai⁶, Chang Liu⁶, Juthathip Mongkolsapaya^6,7, Abbie Brown⁸, Daniel Bailey⁸, Richard Vipond⁸, Nicholas Grayson⁹, Nigel Temperton¹⁰, Sunetra Gupta¹¹, Rutger J Ploeg^12,13, Jai Bolton¹¹, Alex Fyfe¹¹, Robin Gopal⁵, Peter Simmonds¹⁴, Gavin Screaton⁶, Craig Thompson¹¹, Tim Brooks⁸, Maria Zambon⁴, Gail Miflin¹⁵, David J Roberts^16,17

¹National Microbiology Services, NHS Blood and Transplant, London UK;
²Statistics and Clinical Studies, NHS Blood and Transplant, Bristol, UK;
³NHS Blood and Transplant Cambridge, Long Road, Cambridge, CB2 0PT,;
4 Virology Reference Department, National Infection Service, Public Health England, Colindale Avenue, London, UK;
⁵High Containment Microbiology, National Infection Service, Public Health England, Colindale Avenue, London, UK;
⁶Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, OX3 7BN, UK;
⁷Dengue Hemorrhagic Fever Research Unit, Office for Research and Development, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital,

Mahidol University, Bangkok, Thailand;
⁸Rare & Imported Pathogens Laboratory, Public Health England, Porton Down, UK;
⁹Department of Paediatric Medicine, University of Oxford, University of Oxford, Oxford, UK;
¹⁰Medway School of Pharmacy, University of Kent, Chatham, ME4 4BF, UK;
¹¹Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, UK;
¹²Nuffield Department of Surgical Sciences, University of Oxford, OX3 9DU, UK;
¹³Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, OX3 9DU, UK;
¹⁴Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK;
¹⁵NHS Blood and Transplant, North Bristol Park, Filton, Bristol, UK;
¹⁶NHS Blood and Transplant, Oxford, John R adcliffe Hospital, Oxford, OX3 9BQ, UK,
¹⁷Radcliffe Department of Medicine and BRC Haematology Theme, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford, OX3 9DU, UK.

Цель исследования

1. Оценка уровня нейтрализующих антител в плазме доноров, переболевших COVID-19, и определение уровня отсечения (cut-off) для оценки возможности использования такой плазмы в терапевтических целях для проведения клинических исследований.

2. Оценка корреляции между титром нейтрализующих антител (полученным в реакции нейтрализации, микрометод) и результатами ИФА (с использованием лизата инфицированных SARS-CoV-2 клеток и рекомбинантного S-белка, а также 2-х коммерческих наборов).

Тест-системы EUROIMMUN, использовавшиеся при проведении исследования

Набор реагентов Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG; CE-marked)

Образцы

Образцы для исследования были переданы в Оксфордский Университет и Общественное здравоохранение Англии в Портон-Даун.

В исследование включены 52 образца плазмы крови пациентов мужского пола с подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2, полученные по крайней мере через 28 дней после исчезновения симптомов. Образцы были протестированы на наличие РНК с помощью ОТ-ПЦР, на наличие антител методом ИФА с использованием нативного антигена и рекомбинантного S-белка (лабораторные некоммерческие тесты) и 2-х коммерческих наборов, была проведена реакция микронейтрализации с использованием прототипа штамма «Великобритания» (GISAID регистрационный номер EPI/ISL/407073) и реакция нейтрализации вирусного псевдотипа.

Методы

1. ОТ-ПЦР.
2. Реакция микронейтрализации. Вирус инкубировали с плазмой выздоровевших лиц в различных разведениях, затем добавляли суспензию клеток Vero E6. Через 22 часа клетки фиксировали и определяли уровень экспрессии нуклеопротеина SARS-CoV-2 методом ИФА. Отсекающий титр нейтрализующих антител определяли, как разведение сыворотки, нейтрализующей 50% частиц вируса SARS-CoV-2.
3. Анализ нейтрализации псевдотипа на основе лентивируса (YP009724390.1). Интенсивность нейтрализации определяли по снижению экспрессии гена люциферазы.
4. ИФА

С использованием лизата инфицированных клеток. В лунках планшета сорбирован лизат клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2 и неинфицированных. Лизат инфицированных клеток содержал смесь белков вируса, в том числе нуклеокапсидный и S-белок. Индекс ИФА определяли как разницу значений поглощения в лунках с инфицированными и неинфицированными клетками, выраженную относительно калибратора;
С использованием S-белка коронавируса (на основеYP009724390.1). Анализ проводили с использованием 2% обезжиренного молока в ФСБ (фосфатно-солевом буфере) в качестве блокирующего агента и антител к IgG человека, конъюгированных щелочной фосфатазой (A95455; Sigma) в разведении 1: 1000012. Оптические плотности (OD) измеряли при длине волны 405 нм.
Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG); использованный антиген - домен S1 белка шипа вируса (Spike);
Набор реагентов Fortress (cуммарные антитела).

Результаты

Все образцы показали отрицательный результат на наличие РНК SARS-CoV-2.
По результатам реакции микронейтрализации нейтрализующие антитела были обнаружены в 43-х из 52-х протестированных образцов, в качестве отсекающего титра был выбран 1:20.
При исследовании образцов другими методами, антитела к SARS-CoV-2 были обнаружены в большинстве случаев:

1. Анализ нейтрализации псевдотипа: 47 положительных результатов из 51
2. ИФА с использованием лизата клеток: 47 положительных результатов из 50
3. ИФА с использованием рекомбинантного S-белка: 51 положительный результат из 51
4. Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG): 47 положительных результатов из 50

5. Набор реагентов Fortress (Суммарные антитела): 50 положительных результатов из 50

Исходя из полученных данных, все описанные методы демонстрируют высокую чувствительность при выявлении антител у пациентов через 28 дней после выздоровления.
Наибольшую корреляцию с титром нейтрализующих антител продемонстрировал набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) (r² = 0,88, p<0,0001, n=48). Кроме того, была отмечена высокая корреляция результатов, полученных при использовании набора ИФА, основанном на S-белке (r² = 0,76, p<0,0001, n=51) и проведении реакции нейтрализации псевдотипа (r² = 0,82, p<0,0001, n=51).
Для исследования прогностической точности были выбраны набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) и тест, основанный на анализе нейтрализации псевдотипа. Исследование проводили с использованием метода ROC-анализа. Для этого был выбран титр нейтрализующих антител 1:1000, т.к. такой титр является терапевтическим порогом для отбора донорской плазмы. Для оценки чувствительности были выбраны пять значений потенциального уровня отсечения набора EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) (значение RATIO от 6,37 до 10). При RATIO = 9,1 было выявлено 65% образцов доноров, имевших титр, превышающий отсекающий титр нейтрализующих антител 1:100 без ложных результатов. Метод нейтрализации псевдотипа не позволил идентифицировать даже 50% образцов без выдачи ложных результатов.

Выводы

Все использованные методы позволили подтвердить наличие антител к SARS-CoV-2 в образцах пациентов, имевших симптомы COVID-19, полученных по крайней мере через 28 дней после выздоровления. Уровни нейтрализующих антител варьировали от 1:20 до 1:4096. Около 43% образцов плазмы имели уровень нейтрализующих антител выше 1:100.
Для включения образцов плазмы выздоровевших лиц в клинические испытания необходимо определить минимальный титр нейтрализующих антител. Титр антител 1:100 был выбран в качестве прагматического уровня отсечения, который позволяет использовать примерно 40% собранной плазмы.
Для получения плазмы выздоровевших лиц, которую можно использовать в терапии заболевания, необходимо выбрать подходящий метод, который позволит оценивать уровень нейтрализующих антител. Результаты серологической активности, полученные при использовании набора реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) продемонстрировали наибольшую корреляцию с уровнем нейтрализующих антител, полученным в реакции микронейтрализации с живым вирусом.
Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) может быть использован для выявления образцов, содержащих высокий уровень нейтрализующих антител, с высокой специфичностью.

Рис. 1. Сравнение титров нейтрализующих антител с реактивностью, выявленной другими методами - реакцией нейтрализации вирусного псевдотипа и нескольких тестов ИФА. На всех диаграммах образцы расположены по возрастанию вирус-нейтрализующего титра. Использованы следующие значения cut -off: для ИФА с тримером S-белка в качестве антигена - 0,049 (значение ОП); для ИФА наборов Fortress и EUROIMMUN - 1,0 и 1,1 соответственно (отношение «сигнал/cut-off»)

Рис. 2. Корреляционная зависимость между титром нейтрализующих антител с реактивностью, выявленной другими методами - реакцией нейтрализации вирусного псевдотипа и нескольких тестов ИФА. Использован метод линейной регрессии с логарифмической шкалой для обоих методом нейтрализации и для набора EUROIMMUN. Коэффициенты корреляции рассчитаны по непараметрическому методу Спирмана.

Вернуться к списку новостей/статей