| 1 декабря во всем мире ежегодно отмечается День борьбы со СПИДом, провозглашенный WHO/ВОЗ в 1988 году. Пандемия этого заболевания началась более 30 лет назад и унесла уже около 40 миллионов жизней. По данным ООН, в 2013 году в мире насчитывалось 35 миллионов ВИЧ-инфицированных (2 100 000 заразились в течение года), при этом около полутора миллионов человек умерли от СПИДа. В России эпидемическая ситуация по ВИЧ-инфекции остается напряженной, сохраняется тенденция роста числа новых случаев обнаружения антител к ВИЧ (примерно на 13% ежегодно). Около 60% ВИЧ-инфицированных это люди в возрасте до 30 лет, а в возрастной группе 30-34 года пораженность населения РФ ВИЧ-инфекцией достигает 2%. В этой связи своевременная первичная диагностика ВИЧ с использованием экспресс-тестов становится всё более актуальной. В статье С.Д. Зайко "Современные экспресс-тесты в серологической диагностике ВИЧ-инфекции", опубликованной в журнале "Лаборатория" N 3 за 2014 год (скачать статью в формате pdf, 1.6 Мб), освещены практические аспекты быстрого бесприборного определения антител и антегена ВИЧ при помощи метода иммунохроматографии. "Современные экспресс-тесты в серологической диагностике ВИЧ-инфекции" Сергей Дмитриевич Зайко, начальник группы иммунохимии отдела продукции ЗАО «АНАЛИТИКА» Эпидемическая ситуация в Российской Федерации, связанная с широким распространением ВИЧ-инфекции, является весьма серьезной. По данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, число людей, инфицированных ВИЧ, в 2013 году превысило 800 000 человек, из них более 79 000 составили новые случаи. Рост заболеваемости продолжается. При этом, по оценкам специалистов, сопоставимое число ВИЧ-инфицированных лиц не подозревает о своем статусе.
В то же время за последние годы, благодаря внедрению в практику новых антиретровирусных препаратов, созданы условия не только для долгосрочной ремиссии у больных, но и предотвращения репликации вируса у бессимптомных носителей ВИЧ. Это, в свою очередь, снижает риск инфицирования других лиц и является важным фактором стабилизации распространения ВИЧ в США и странах Западной Европы.
Поэтому одной из важнейших задач в борьбе с распространением эпидемии ВИЧ-инфекции является максимально широкий скрининг среди населения, имеющий целью выявление лиц, инфицированных ВИЧ и не знающих об этом. В США, в соответствии с рекомендациями 2006 года , объектом таких скрининговых исследований должны быть все лица, обращающиеся за помощью в медицинские учреждения, и все беременные женщины. Такой скрининг проводится на добровольной основе, однако при этом используются все предоставляющиеся возможности для обследования. Обследование беременных женщин включено в стандартный перечень проводимых лабораторных анализов. Каждому человеку, обращающемуся за медицинской помощью, предлагается провести определение серологических маркеров ВИЧ-инфекции и разъясняется целесообразность этого. Письменного согласия больного на проведение исследования не требуется. Анализ проводится, если больной не отказывается от него.
В России, согласно существующим нормативным документам , обязательному обследованию подлежат: доноры крови и других биологических жидкостей, тканей и органов; медицинские и научные работники, имеющие контакт с ВИЧ-инфицированными лицами и материалами, содержащими ВИЧ; медицинские работники хирургического профиля; военнослужащие; иностранные граждане, обращающиеся за видом на жительство или разрешением на работу. Рекомендуется также обследование всех беременных женщин (с обязательным письменным согласием). Обследование остального населения, в том числе пациентов лечебных учреждений общего профиля, является добровольным. Специальная беседа, направленная на то, чтобы убедить пациента в необходимости узнать свой ВИЧ-статус, в обязанности врача не входит и проводится далеко не всегда. Представляется, что дополнительные пропагандистские усилия, направленные на расширение контингента обследованных лиц, могли бы быть важным фактором, сдерживающим распространение эпидемии.
Важнейшим фактором, позволяющим решать задачу широкого скрининга, является наличие высокочувствительных и специфичных средств лабораторной диагностики. При этом для первичного исследования обычно используют тест-системы, основанные на методе иммуноферментного анализа (ИФА), с дальнейшим подтверждением положительных результатов в реакции иммуноблоттинга. Это стандартный алгоритм тестирования, которое, как правило, занимает несколько дней.
В последние годы все больший интерес вызывает возможность использования иммунохроматографических экспресс-тестов. Их чувствительность практически не уступает чувствительности ИФА тест-систем. В то же время, две основные их особенности - малое время и простота методики анализа - в ряде случаев определяют преимущество использования этих тестов перед стандартным алгоритмом. Во-первых, это относится к экстренным ситуациям, когда результат анализа должен быть получен как можно быстрее. Как правило, время анализа не превышает 20-30 минут, положительный результат обычно регистрируется еще раньше. Во-вторых, экспресс-тесты можно использовать в условиях, когда применение обычных скрининговых тестов ИФА почему-либо невозможно или затруднено, например, если исследование проводится в отдаленных или изолированных территориях. Тесты достаточно просты для того, чтобы их мог использовать любой человек, для их проведения не требуется никакое оборудование. Как правило, они хранятся при комнатной температуре и для их транспортировки не нужна "холодовая цепь". Таким образом, экспресс-тесты могут быть использованы медицинским персоналом без специальной подготовки и при слабой инфраструктурной оснащенности территории. Важным фактором является возможность использования для анализа цельной крови, в том числе капиллярной, что также позволяет упростить исследование и выиграть время.
Возможность применения экспресс-тестов предусмотрена Санитарно-эпидемиологическими правилами "Профилактика ВИЧ-инфекции" (2010). Исходя из конструктивных и функциональных характеристик экспресс-тестов, можно ожидать, что их применение будет эффективно в следующих случаях:
1) Обследование беременных женщин с неизвестным ВИЧ-статусом непосредственно перед родами и в процессе родов. В соответствии с существующими рекомендациями , при получении положительного результата рекомендуется немедленное применение антиретровирусной терапии с целью снижения риска заражения новорожденного, не дожидаясь результатов повторных анализов (ИФА, иммуноблоттинг). Кроме того, такое экспресс-исследование рекомендуется и при родах женщин, входящих в высокую группу риска инфицирования ВИЧ, даже если проведенные ранее во время беременности обследования дали отрицательные результаты;
2) Установленный или предполагаемый контакт медицинского персонала с кровью или другими биологическими жидкостями больного, ВИЧ-статус которого неизвестен. Существующие рекомендации предусматривают срочное использование экспресс-тестов для выяснения статуса больного и, при положительном результате, немедленное начало профилактической антиретровирусной терапии;
3) Экстренная гемотрансфузия - при отсутствии предварительно тестированной крови;
4) Трансплантология - при заборе органов для пересадки;
5) Первичная серологическая диагностика при обстоятельствах, когда использование иммуноферментных тест-систем почему-либо невозможно или затруднительно;
6) Первичное серологическое обследование представителей маргинальных групп населения, обратившихся за той или иной медицинской помощью, если есть основания предполагать, что повторный визит с целью узнать результат обследования может не состояться;
7) В некоторых случаях - срочная дифференциальная диагностика у больного с неизвестным ВИЧ-статусом, но входящего в группу высокого риска инфицирования (например, исключение пневмонии, вызванной Pneumocystis jirovecii, у больного в тяжелом состоянии, поступившего по скорой помощи).
Появление новых и совершенствование существующих экспресс-тестов является одним из наиболее быстро развивающихся направлений иммуноанализа. Как правило, современные экспресс-тесты, предназначенные для серологической диагностики ВИЧ-инфекции, имеют чувствительность более 99,5% и не уступают по этому показателю ИФА тест-системам. Стандартом для современной ИФА тест-системы уже много лет является одновременное выявление как антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, так и антигена p24 ВИЧ - формат, позволяющий за счет обнаружения антигена в среднем на 6-8 дней сократить «сероконверсионное окно» (период времени от момента заражения до появления первых антител). Но в последние годы появились и иммунохроматографические экспресс-тесты четвертого поколения, с помощью которых можно одновременно выявлять и антиген ВИЧ, и антитела к ВИЧ-1/ВИЧ-2. Более того, в отличие от стандартных наборов ИФА, по результату теста можно сразу определить, какой именно из определяемых маркеров инфекции присутствует в крови больного.
Рассмотрим принцип работы современного экспресс-теста на примере иммунохроматографической тест-системы SD BIOLINE HIV Ag/Ab Combo производства компании Standard Diagnostics, Inc. (Южная Корея).
Тестовое устройство (тест-кассета) представляет собой помещенную в пластмассовый корпус полоску нитроцеллюлозной мембраны, в определенных областях которой в виде полос иммобилизованы: а) рекомбинантные антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2; б) стрептавидин; в) козьи поликлональные антитела к IgG мыши. К мембране прилегает пористая прослойка, в которой находится смесь лиофилизированных антител и конъюгатов: 1) антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2, конъюгированные с частицами коллоидного золота; 2) моноклональные антитела к p24, конъюгированные с частицами коллоидного золота; 3) биотинилированные моноклональные антитела к антигену p24. При этом антитела, использованные для биотинилирования и приготовления конъюгата, являются продуктом разных гибридом и распознают разные эпитопы антигена p24.
Образец (50 мкл), добавленный в специальное окошко, растворяет лиофилизированные конъюгаты и смешивается с ними. Если в образце присутствуют антиген p24 или антитела к ВИЧ, они связываются соответственно с антителами и антигенами, входящими в состав соответствующих конъюгатов. Образовавшаяся смесь движется вдоль стрипа. При наличии в образце антител к ВИЧ-1/ВИЧ-2 комплекс «конъюгат гликопротеинов + антитела из образца» связывается с гликопротеинами, иммобилизованными в зоне 1. Если в образце присутствует антиген p24, комплекс «конъюгат антител к p24 + p24 из образца + биотинилированные антитела к p24» захватывается молекулами стрептавидина, иммобилизованными в зоне 2. В результате фиксации иммунных комплексов происходит концентрирование частиц коллоидного золота и образование окрашенных полос.
При отсутствии в образце маркеров ВИЧ-инфекции иммунные комплексы не образуются и соответствующие окрашенные полосы не появляются. В контрольной зоне фиксируются молекулы конъюгата антител к p24, не захваченные в зоне 2. Образовавшаяся контрольная полоса свидетельствует о том, что молекулы реакционной смеси дошли до конца рабочей области мембраны, т.е. хроматография проведена корректно.
Экспресс-тест предназначен для исследования цельной крови (венозной или капиллярной), сыворотки и плазмы крови. Время анализа - до 20 минут.
Использование высокоаффинных моноклональных антител позволяет добиться уровня чувствительности, сопоставимого с чувствительностью современных иммуноферментных тест-систем. Так, при исследовании экспресс-теста, проведенного в рамках программы Всемирной организации здравоохранения специалистами Института тропической медицины (Антверпен, Бельгия), были получены следующие результаты :
1. При исследовании панели ВОЗ (1081 клинический образец, 423 положительных и 658 отрицательных, охарактеризованных методами ИФА и иммуноблоттинга) чувствительность составила 100% (99,1%-100%, доверительный интервал 0,95), специфичность - 99,1% (98,0%-99,7%, 0,95).
2. Исследование 8-ми сероконверсионных панелей (производства компании BBI, США, номера PRB 914, 925, 926, 930, 955, 965, 968, 969) показало, что экспресс-тест SD BIOLINE HIV Ag/Ab Combo выявляет первый положительный образец, содержащий антиген p24, как минимум не хуже, чем референсная ИФА тест-система. В одном случае с помощью экспресс-теста был выявлен более ранний образец сероконверсионной панели.
3. Исследование панели PRB205 (часть положительных образцов панели содержит антиген, часть - антитела в разных титрах) - чувствительность 100%, специфичность 100%.
4. При титровании стандартного образца антигена p24 (NIBSC 90/636) экспресс-тест SD BIOLINE HIV Ag/Ab Combo выявлял p24 в минимальной концентрации 3,125 МЕ/мл (референсная ИФА тест-система - 6,25 МЕ/мл).
5. Экспресс-тест выявляет антитела к ВИЧ-2 и ко всем исследованным субтипам ВИЧ-1, включая субтип O, при исследовании панели NIBSC 02/210.
В качестве референсной тест-системы использовался набор VIRONOSTIKA HIV Ag/Ab (bioMerieux, Франция).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспресс-тест SD BIOLINE HIV Ag/Ab Combo может быть использован для проведения первичного (скринингового) серологического исследования на ВИЧ-инфекцию, в частности, в ситуациях, охарактеризованных выше. При этом, в соответствии с утвержденным алгоритмом исследования, полученные результаты должны быть подтверждены другим методом (ИФА), а затем в реакции иммуноблоттинга.
Применение средств серологической экспресс-диагностики ВИЧ-инфекции, не уступающих по качеству иммуноферментным наборам, не только является единственной возможностью экстренного определения ВИЧ-статуса больного или биологического материала, но и открывает дополнительные возможности для расширения обследования населения с целью выявления носителей вируса и своевременного начала их лечения, что, в свою очередь, способствует снижению риска инфицирования других лиц. Литература
1. Branson B.M., Handsfield H., Lampe M.A., Janssen R.S., Taylor A.W., Lyss S.B., Clark J.E. Revised Recommendations for HIV Testing of Adults, Adolescents, and Pregnant Women in Health-Care Settings. CDC Morbidity and Mortality World Report, 55 (RR14), 1-17, 2006
2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.5.2826-10. Профилактика ВИЧ-инфекции. М., 2010. 3. Афонина Л.Ю., Воронин Е.Е., Фомин Ю.А., Юрин О.Г., Козырина Н.В. Современные подходы к применению антиретровирусных препаратов в комплексе мер, направленных на профилактику передачи ВИЧ от матери ребенку (практические рекомендации). М., 21 ноября 2011 г. 4. Ладная Н.Н., Нарсия Р.С., Юрин О.Г., Козырина Н.В., Буравцова Е.В. «Постконтактная профилактика заражения ВИЧ-инфекцией». Пособие для медицинских работников. М., 2009. 5. WHO evaluation of SD BIOLINE HIV Ag/Ab Combo (Standard Diagnostics), Final Report. WHO Collaborating Centre for HIV/AIDS Diagnostic and Laboratory Support Department of Clinical Science, Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium, 27 February 2013
who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/130322_0069_012_00_public_report_final_v1.pdf |
