Паратиреоидный гормон, PTH, количествопред., ИФА (Biomerica, США)

Назначение

Тест Biomerica Интактный ПТГ (Biomerica Intact-PTH ELISA) – диагностическая иммуноферментная тест-система для количественного in vitro определения интактного ПТГ (паратиреоидного гормона) в сыворотке крови человека.

Введение

ПТГ (паратиреоидный гормон, паратгормон, паратирин) является продуктом биосинтеза паращитовидных желез. Первоначально он синтезируется в виде пре-пропаратиреоидного гормона, более крупной молекулы-предшественника, состоящей из 115 аминокислот. После последующего внутриклеточного отщепления участка из 25 аминокислот пре-пропаратиреоидный гормон превращается в промежуточный пропаратиреоидный гормон – полипептид, состоящий из 90 аминокислот. Вследствие дополнительной протеолитической модификации из пропаратиреоидного гормона образуется паратиреоидный гормон, полипептид, состоящий из 84 аминокислот. У здоровых людей регуляция секреции паратгормона обычно осуществляется по принципу отрицательной обратной связи при воздействии кальция сыворотки крови на паращитовидные железы. Интактный ПТГ биологически активен, он быстро выводится из кровообращения, имея период полураспада менее четырех минут ПТГ подвергается протеолизу в паращитовидных железах, но главным образом в других органах, в основном в печени, а также в почках и в костной ткани. При этом образуются N-концевые фрагменты и более длительно существующие С-концевые фрагменты и фрагменты центральной части молекулы. У пациентов с почечной недостаточностью обычно выявляются повышенные концентрации ПТГ при анализе С-концевых фрагментов и фрагментов центральной части молекулы ПТГ вследствие ухудшения почечного очищения

Клиническое значение

Определение концентрации интактного ПТГ в сыворотке крови используется для дифференциальной диагностики первичного гиперпаратиреоидизма от других (не связанных с паращитовидными железами) форм гиперкальциемии, таких как гиперкальциемия, вызванная образованием злокачественной опухоли, саркоидозом и тиреотоксикозом. Измерение концентрации паратгормона является наиболее специфичным методом при постановке диагноза первичного гиперпаратиреоидизма. При наличии гиперкальциемии повышенные уровни паратгормона являются, в сущности, основанием для постановки диагноза. Более чем у 90% пациентов с первичным гиперпаратиреоидизмом концентрации паратгормона повышены Другая наиболее частая форма гиперкальциемии, а именно раковая гиперкальциемия, сопровождается пониженными или нормальными уровнями паратгормона. При сравнении уровней интактного ПТГ и сывороточного кальция концентрации интактного ПТГ у пациентов с гиперкальциемией опухолевого характера почти всегда были непропорционально низки, относительно повышенных уровней сывороточного кальция В отличие от анализа С-концевых фрагментов и фрагментов центральной части молекулы ПТГ, концентрации которых обычно значительно повышаются у пациентов с почечной недостаточностью, определение интактного ПТГ менее подвержено влиянию ухудшения функционирования почек ПТГ обычно не выявляется у больных с гипокальциемией, обусловленной общим гипопаратиреоидизмом, однако концентрации ПТГ остаются в норме при гипокальциемии, вызванной утратой или подавлением функции паращитовидных желез.

Принцип метода

Тест Biomerica Интактный ПТГ (Biomerica Intact PTH ELISA) представляет собой твердофазный метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения концентрации биологически интактной цепи ПТГ, состоящей из 84 аминокислот. В тесте используются козьи поликлональные антитела к ПТГ человека двух типов, очищенные с помощью аффинной хроматографии, специфичные к строго определенным областям молекулы ПТГ. Одно антитело после обработки приобрело способность связываться только с центральными и С-концевыми 39-84 аминокислотами молекулы ПТГ, оно биотинилировано. Другому антителу придано свойство связываться только с N-концевыми 1-34 аминокислотами молекулы ПТГ; это антитело мечено пероксидазой из корня хрена (HRP) для проявления. Хотя фрагменты центральной части и С-концевые фрагменты молекулы ПТГ связываются с биотинилированными антителами анти-ПТГ (39-84), только интактный ПТГ 1-84 образует сэндвич-комплекс, необходимый для проявления. Как биотинилированные антитела, так и стрептавидин, покрывающий лунки, были обработаны таким образом, чтобы снизить до незначительного уровня влияние неактивных фрагментов даже при очень высоких их концентрациях. В данном анализе калибраторы, контроли или образцы сыворотки крови пациентов одновременно инкубируют с конъюгированными с ферментом антителами и меченными биотином антителами в лунках микропланшета, покрытых стрептавидином. После инкубации лунки планшета промывают для удаления несвязавшихся компонентов. Фермент, связавшийся с твердой фазой, инкубируют с субстратом, тетраметилбензидином (ТМБ). Реакцию останавливают добавлением в лунки кислотного стоп-реагента, при этом цвет раствора становится желтым. Интенсивность желтого окрашивания прямо пропорциональна концентрации ПТГ в образце. На основании данных по калибраторам строится калибровочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации ПТГ в калибраторах. Концентрацию ПТГ в контролях и исследуемых образцах определяют непосредственно по этой кривой.