Аналитика
телефоны: (495) 737-03-63
748-11-68
в лабораторной диагностике с 1989 года
 
 


ЗАО "АНАЛИТИКА", Москва
телефоны: (495) 748-11-69, 737-03-63, (800) 200-19-89, факс: 737-03-65
www.analytica.ru , www.аналитика.рф , info@analytica.ru

 
 

О методах обнаружения антител к SARS-CoV-2 и их корреляции с уровнем нейтрализующих антител

16 июля 20
Реконвалесцентная плазмотерапия для лечения пациентов с COVID-19: оценка эффективности, доступные методы обнаружения антител и их корреляция с уровнем нейтрализующих антител
 
Публикация: "Convalescent plasma therapy for the treatment of patients with COVID-19: Assessment of methods available for antibody detection and their correlation with neutralising antibody levels" - оригинал статьи в pdf 
 
Heli Harvala1, Matthew L Robb2, Nick Watkins3, Samreen Ijaz4, Steven Dicks4, Monika Patel5Piyada Supasa6, Wanwisa Dejnirattisai6, Chang Liu6, Juthathip Mongkolsapaya6,7, Abbie Brown8Daniel Bailey8, Richard Vipond8, Nicholas Grayson9, Nigel Temperton10, Sunetra Gupta11, Rutger J Ploeg12,13Jai Bolton11, Alex Fyfe11, Robin Gopal5Peter Simmonds14, Gavin Screaton6, Craig Thompson11Tim Brooks8, Maria Zambon4, Gail Miflin15, David J Roberts16,17


National Microbiology Services, NHS Blood and Transplant, London UK;
Statistics and Clinical Studies, NHS Blood and Transplant, Bristol, UK; 
NHS Blood and Transplant Cambridge, Long Road, Cambridge, CB2 0PT,;
4 Virology Reference Department, National Infection Service, Public Health England, Colindale Avenue, London, UK;
High Containment Microbiology, National Infection Service, Public Health England, Colindale Avenue, London, UK;
Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, OX3 7BN, UK;
Dengue Hemorrhagic Fever Research Unit, Office for Research and Development, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital,
  Mahidol University, Bangkok, Thailand;
Rare & Imported Pathogens Laboratory, Public Health England, Porton Down, UK;
Department of Paediatric Medicine, University of Oxford, University of Oxford, Oxford, UK;
10 Medway School of Pharmacy, University of Kent, Chatham, ME4 4BF, UK;
11 Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, UK;
12 Nuffield Department of Surgical Sciences, University of Oxford, OX3 9DU, UK;
13 Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, OX3 9DU, UK;
14 Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, UK;
15 NHS Blood and Transplant, North Bristol Park, Filton, Bristol, UK;
16 NHS Blood and Transplant, Oxford, John R adcliffe Hospital, Oxford, OX3 9BQ, UK,
17 Radcliffe Department of Medicine and BRC Haematology Theme, University of Oxford, John Radcliffe Hospital, Oxford, OX3 9DU, UK.
 

Цель исследования

1. Оценка уровня нейтрализующих антител в плазме доноров, переболевших COVID-19, и определение уровня отсечения (cut-off) для оценки возможности использования такой плазмы в терапевтических целях для проведения клинических исследований. 
2. Оценка корреляции между титром нейтрализующих антител (полученным в реакции нейтрализации, микрометод) и результатами ИФА (с использованием лизата инфицированных SARS-CoV-2 клеток и рекомбинантного S-белка, а также 2-х коммерческих наборов). 

 
Тест-системы EUROIMMUN, использовавшиеся при проведении исследования
Набор реагентов Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG; CE-marked)
 
 

Образцы

Образцы для исследования были переданы в Оксфордский Университет и Общественное здравоохранение Англии в Портон-Даун.
В исследование включены 52 образца плазмы крови пациентов мужского пола с подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2, полученные по крайней мере через 28 дней после исчезновения симптомов. Образцы были протестированы на наличие РНК с помощью ОТ-ПЦР, на наличие антител методом ИФА с использованием нативного антигена и рекомбинантного S-белка (лабораторные некоммерческие тесты) и 2-х коммерческих наборов, была проведена реакция микронейтрализации с использованием прототипа штамма «Великобритания» (GISAID регистрационный номер EPI/ISL/407073) и реакция нейтрализации вирусного псевдотипа.

 
Методы
 
1. ОТ-ПЦР.
2. Реакция микронейтрализации. Вирус инкубировали с плазмой выздоровевших лиц в различных разведениях, затем добавляли суспензию клеток Vero E6. Через 22 часа клетки фиксировали и определяли уровень экспрессии нуклеопротеина SARS-CoV-2 методом ИФА. Отсекающий титр нейтрализующих антител определяли, как разведение сыворотки, нейтрализующей 50% частиц вируса SARS-CoV-2.
3. Анализ нейтрализации псевдотипа на основе лентивируса (YP009724390.1). Интенсивность нейтрализации определяли по снижению экспрессии гена люциферазы.
4. ИФА
  • С использованием лизата инфицированных клеток. В лунках планшета сорбирован лизат клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2 и неинфицированных. Лизат инфицированных клеток содержал смесь белков вируса, в том числе нуклеокапсидный и S-белок. Индекс ИФА определяли как разницу значений поглощения в лунках с инфицированными и неинфицированными клетками, выраженную относительно калибратора;
  • С использованием S-белка коронавируса (на основеYP009724390.1). Анализ проводили с использованием 2% обезжиренного молока в ФСБ (фосфатно-солевом буфере) в качестве блокирующего агента и антител к IgG человека, конъюгированных щелочной фосфатазой (A95455; Sigma) в разведении 1: 1000012. Оптические плотности (OD) измеряли при длине волны 405 нм.
  • Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG); использованный антиген - домен S1 белка шипа вируса (Spike);
  • Набор реагентов Fortress (cуммарные антитела).

Результаты

Все образцы показали отрицательный результат на наличие РНК SARS-CoV-2.
По результатам реакции микронейтрализации нейтрализующие антитела были обнаружены в 43-х из 52-х протестированных образцов, в качестве отсекающего титра был выбран 1:20.
При исследовании образцов другими методами, антитела к SARS-CoV-2 были обнаружены в большинстве случаев:

1. Анализ нейтрализации псевдотипа: 47 положительных результатов из 51
2. ИФА с использованием лизата клеток: 47 положительных результатов из 50
3. ИФА с использованием рекомбинантного S-белка: 51 положительный результат из 51
4. Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG): 47 положительных результатов из 50
5. Набор реагентов Fortress (Суммарные антитела): 50 положительных результатов из 50 
 
Исходя из полученных данных, все описанные методы демонстрируют высокую чувствительность при выявлении антител у пациентов через 28 дней после выздоровления. 
Наибольшую корреляцию с титром нейтрализующих антител продемонстрировал набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) (r2 = 0,88, p<0,0001, n=48). Кроме того, была отмечена высокая корреляция результатов, полученных при использовании набора ИФА, основанном на S-белке (r2 = 0,76, p<0,0001, n=51) и проведении реакции нейтрализации псевдотипа (r2 = 0,82, p<0,0001, n=51).
Для исследования прогностической точности были выбраны набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) и тест, основанный на анализе нейтрализации псевдотипа. Исследование проводили с использованием метода ROC-анализа. Для этого был выбран титр нейтрализующих антител 1:1000, т.к. такой титр является терапевтическим порогом для отбора донорской плазмы. Для оценки чувствительности были выбраны пять значений потенциального уровня отсечения набора EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) (значение RATIO от 6,37 до 10). При RATIO = 9,1 было выявлено 65% образцов доноров, имевших титр, превышающий отсекающий титр нейтрализующих антител 1:100 без ложных результатов. Метод нейтрализации псевдотипа не позволил идентифицировать даже 50% образцов без выдачи ложных результатов.
 

Выводы

  • Все использованные методы позволили подтвердить наличие антител к SARS-CoV-2 в образцах пациентов, имевших симптомы COVID-19, полученных по крайней мере через 28 дней после выздоровления. Уровни нейтрализующих антител варьировали от 1:20 до 1:4096. Около 43% образцов плазмы имели уровень нейтрализующих антител выше 1:100.
  • Для включения образцов плазмы выздоровевших лиц в клинические испытания необходимо определить минимальный титр нейтрализующих антител. Титр антител 1:100 был выбран в качестве прагматического уровня отсечения, который позволяет использовать примерно 40% собранной плазмы.
  • Для получения плазмы выздоровевших лиц, которую можно использовать в терапии заболевания, необходимо выбрать подходящий метод, который позволит оценивать уровень нейтрализующих антител. Результаты серологической активности, полученные при использовании набора реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) продемонстрировали наибольшую корреляцию с уровнем нейтрализующих антител, полученным в реакции микронейтрализации с живым вирусом.
  • Набор реагентов EUROIMMUN Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG) может быть использован для выявления образцов, содержащих высокий уровень нейтрализующих антител, с высокой специфичностью.

Рис. 1. Сравнение титров нейтрализующих антител с реактивностью, выявленной другими методами - реакцией нейтрализации вирусного псевдотипа и нескольких тестов ИФА. На всех диаграммах образцы расположены по возрастанию вирус-нейтрализующего титра. Использованы следующие значения cut -off: для ИФА с тримером S-белка в качестве антигена - 0,049 (значение ОП); для ИФА наборов Fortress и EUROIMMUN - 1,0 и 1,1 соответственно (отношение «сигнал/cut-off»)

 

Рис. 2. Корреляционная зависимость между титром нейтрализующих антител с реактивностью, выявленной другими методами - реакцией нейтрализации вирусного псевдотипа и нескольких тестов ИФА. Использован метод линейной регрессии с логарифмической шкалой для обоих методом нейтрализации и для набора EUROIMMUN. Коэффициенты корреляции рассчитаны по непараметрическому методу Спирмана. 

 

Публикация: "Convalescent plasma therapy for the treatment of patients with COVID-19: Assessment of methods available for antibody detection and their correlation with neutralising antibody levels" - оригинал статьи в pdf

 

« предыдущая новость (4) список новостей (43) следующая новость »